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红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原未知功能结构域 (DUF1943)的原核表达及纯化鉴定
王瑞,韦孜娜,吕敏,杨彦豪,黄黎明,韦秀颖,卢天和,黄光华,杨慧赞
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(广西壮族自治区水产科学研究院,南宁 530021;广西大学动物科学技术学院,南宁 530005)
摘要:
通过外源表达并纯化得到红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)的DUF1943结构域片段,为开展其后续相关功能及机制研究奠定基础。根据GenBank数据库中公布的红螯螯虾卵Vg基因序列(登录号AF306784.1),查找到DUF1943结构域的氨基酸序列(617—918aa),对其理化性质与基本结构等进行了理论评估,结合大肠杆菌密码子偏好对其进行了序列改造和密码子优化,采用全基因合成的方法得到了DUF1943的基因片段,将其连接到Pet28a(+)内构建了Pet28a(+)-DUF1943的融合表达载体,探索了该融合载体在大肠杆菌系统中的最佳表达参数,采用溶解法和上柱层析法对收获到的蛋白包涵体进行复性。全基因合成方法制备得到的DUF1943目的基因为921 bp,成功构建了Pet28a(+)-DUF1943的融合表达载体,诱导Pet28a(+)-DUF1943表达的最佳条件为:当单克隆菌液OD600达到0.6 时,添加0.5 mmol·L-1 的诱导剂IPTG,置于37 ℃条件下培养4 h。表达的DUF1943多肽以包涵体形式为主,在SDS-PAGE胶的35 kDa附近呈现特异性条带,收集包涵体进行破碎,经2 mol·L-1盐酸胍溶解和Ni-NTA层析后最终收获到的活性蛋白浓度为0.6 mg·mL-1。成功构建了Pet28a(+)-DUF1943原核表达载体并优化了表达系统及蛋白复性方案,获得了DUF1943活性多肽,为进一步研究其生物功能及应用奠定了基础。
关键词:  卵黄蛋白原  DUF1943基因  原核表达  纯化  复性
DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.021
基金项目:广西科技重大专项课题(桂科AA17204095-5), 广西自然科学基金项目(2019GXNSFAA185036), 广西重点研发项目(桂科AB18221068)和广西科技重大专项(桂科AA17204094-7)共同资助。
Prokaryotic expression and purification of the domain of unknown function of vitellogenin (DUF1943) in Cherax quadricarinatus
WANG Rui,WEI Zina,LYU Min,YANG Yanhao,HUANG Liming,WEI Xiuying,LU Tianhe,HUANG Guanghua,YANG Huizan
(Guangxi Academy of Fishery Sciences, Nanning 530021;College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005)
Abstract:
Key words:  Cherax quadricarinatus  DUF1943  prokaryotic expression  purification  renaturation

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