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茶树谷氨酸脱羧酶基因(GAD)的原核表达及酶活快速检测
韩洁云,宛晓春,邓威威
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(安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室,合肥 230036)
摘要:
L-谷氨酸经脱羧酶反应可生成γ-氨基丁酸(GABA),此过程受谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化。从茶树转录组库中筛选GAD基因,通过NCBI比对获得其cDNA序列(GenBank登录号为KT728367.1)。序列分析表明,GAD基因的ORF全长为1 482 bp,共编码493个氨基酸,该蛋白为细胞质蛋白,分子量为55.49 kDa,理论等电点为5.44。从舒茶早茶树根部中克隆该基因,并构建pMAL-c5X-GAD表达载体,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,得到分子量约为55 kDa的目的蛋白。体外酶活反应后用薄层色谱法(TLC)分析,经BAW (Butanol:Acetic acid:H2O,4:1:2)和75%苯酚水溶液(Phenol:H2O,3:1)2种展开剂分离酶促产物,均可检测到GABA的生成。通过实时荧光定量PCR对GAD基因在不同茶树组织的表达水平进行检测,发现GAD在根中表达量最高,而在芽中表达量最低,在其他组织中表达各不相同,其表达具有组织特异性。
关键词:  茶树  谷氨酸脱羧酶  原核表达  TLC  实时荧光定量PCR
DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.20180302.003
投稿时间:2017-07-02
基金项目:安徽省自然科学基金(1608085QC60)和国家自然科学基金(31300576)共同资助。
Prokaryotic expression of the glutamic acid decarboxylase gene (GAD) in Camellia sinensis and rapid determination of its enzyme activity
HAN Jieyun,WAN Xiaochun,DENG Weiwei
(State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)
Abstract:
Key words: Camellia sinensis; glutamic acid decarboxylase; prokaryotic expression;TLC; qRT-PCR
Key words:  

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