茶树谷氨酸脱羧酶基因(GAD)的原核表达及酶活快速检测
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安徽省自然科学基金(1608085QC60)和国家自然科学基金(31300576)共同资助。


Prokaryotic expression of the glutamic acid decarboxylase gene (GAD) in Camellia sinensis and rapid determination of its enzyme activity
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    L-谷氨酸经脱羧酶反应可生成γ-氨基丁酸(GABA),此过程受谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化。从茶树转录组库中筛选GAD基因,通过NCBI比对获得其cDNA序列(GenBank登录号为KT728367.1)。序列分析表明,GAD基因的ORF全长为1 482 bp,共编码493个氨基酸,该蛋白为细胞质蛋白,分子量为55.49 kDa,理论等电点为5.44。从舒茶早茶树根部中克隆该基因,并构建pMAL-c5X-GAD表达载体,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,得到分子量约为55 kDa的目的蛋白。体外酶活反应后用薄层色谱法(TLC)分析,经BAW (Butanol:Acetic acid:H2O,4:1:2)和75%苯酚水溶液(Phenol:H2O,3:1)2种展开剂分离酶促产物,均可检测到GABA的生成。通过实时荧光定量PCR对GAD基因在不同茶树组织的表达水平进行检测,发现GAD在根中表达量最高,而在芽中表达量最低,在其他组织中表达各不相同,其表达具有组织特异性。

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    Key words: Camellia sinensis; glutamic acid decarboxylase; prokaryotic expression;TLC; qRT-PCR

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  • 收稿日期:2017-07-02
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  • 在线发布日期: 2018-03-20